Konfokalmikroskopi og anvendelse af lasere

I de senere år har en særlig teknik, såkaldt konfokalmikroskopi, vundet stor udbredelse. Teknikken benytter sig af en laser som lyskilde. Metoden er simpel, hurtig og robust og har derfor et bredt anvendelsesområde. Den har imidlertid også en række ulemper. For det første belyses hele det konfokale rumfang på én gang, hvilket leder til hurtigere blegning og nedbrydning af det studerede emne. For det andet er fluorescenssignalet påvirket af lysspredning fra dele af emnet, som ikke afbildes, hvilket er et særligt problem for lange eksitationsbølgelængder. Endelig er metodens følsomhed lineært afhængig af laserens intensitet, hvilket betyder, at det kan være vanskeligt at afbilde fluorescerende molekyler, som findes i meget lav koncentration.

Princippet i et konfokalmikroskop

Laserskanning gennem et liposom (til venstre) gennem en række planer, som hver giver en fluorescenskontur (i midten), og som bagefter kan rekonstrueres til et tredimensionalt billede af liposomet (til højre). Liposomet består her af en blanding af fedtstoffer, som ligner indholdet i huden.

Almindelig konfokalmikroskopi kunne også kaldes enkelt-foton fluorescens, idet de fluorescerende molekyler eksiteres ved, at de bliver ramt af en enkelt foton med en bestemt bølgelængde fra laseren. Nogle af de nævnte ulemper ved konfokalmikroskopi kan afbødes ved, at man i stedet for at bruge en enkelt foton anvender flere fotoner samtidigt ved eksitationen, såkaldt multi-foton fluorescensmikroskopi. I tilfælde af to-foton excitation består princippet i at eksitere fluorescensen af molekylerne med to fotoner samtidig. Hver foton leverer så halvdelen af eksitationsenergien. Da denne proces er ikke-linær, kræves der meget høje fotontætheder, som opnås ved at fokusere en kraftig laser på et diffraktions-begrænset område gennem en særlig blænderåbning. Hermed sker der ikke absorption i områderne over og under fokalplanen, fordi fotonfluksen er for lille. På denne måde er det muligt at skanne en række planer som i konfokalmikroskopi og derefter sammensætte tre-dimensionale billeder, vel at mærke uden at belyse andet end fokalplanen. Hermed optræder mindre lysspredning, og graden af blegning og nedbrydning af prøven formindskes. Det leder til høj opløsningsevne og et højt signal/støjforhold. Det betyder også, at to-fotonteknikken giver en væsentlig større gennemtrængningsdybde af prøven, hvilket er vigtigt for studiet af levende væv. Endelig skal nævnes, at to-foton princippet tillader, at man kan eksitere mange forskellige fluorescerende molekyler samtidigt. Denne mulighed kan udnyttes til at udføre studier af fluorescerende molekyler med forskellige farver på samme tid uden at ændre eksitationsbølgelængden på laseren.